PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉?wèn)題：

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTC CTTAA↑G
PstⅡ	CAG↓CTG GTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACC CCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCC CCTAG↑G

注：箭頭表示切割位點(diǎn)
（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過(guò)程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增目的基因。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

EcoRⅠ

EcoRⅠ

和

PstⅡ

PstⅡ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列，為此需要將兩種酶的識(shí)別序列分別設(shè)計(jì)在兩種引物的

5’

5’

端（填5'或3'）。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T₄

T₄

（填“E.coli”或“T₄”）DNA連接酶。
（3）轉(zhuǎn)化前需用

Ca²⁺或CaCl₂

Ca²⁺或CaCl₂

處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。
（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，

3

3

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。