瑞典遺傳學(xué)家斯萬特?帕博從大量木乃伊中獲得少量木乃伊DNA，并在大腸桿菌中進(jìn)行克隆，復(fù)制了2400年前的DNA，榮獲2022年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。某興趣小組的同學(xué)模擬了其中部分研究過程。請(qǐng)回答下列問題：
（1）該興趣小組的同學(xué)為了提高實(shí)驗(yàn)成功率，采用PCR技術(shù)對(duì)木乃伊基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系中需添加的物質(zhì)有緩沖液、

模板DNA、TaqDNA聚合酶

模板DNA、TaqDNA聚合酶

（答出兩點(diǎn)），dNTP和引物等，引物需要根據(jù)

木乃伊基因兩端特定的堿基序列

木乃伊基因兩端特定的堿基序列

進(jìn)行設(shè)計(jì)。一個(gè)該DNA分子在PCR儀中經(jīng)過4次循環(huán)，需要

30

30

個(gè)引物。
（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)需要使用的酶有

限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶

限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶

，重組質(zhì)粒上啟動(dòng)子的作用是

RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)并驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)并驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA

。在向大腸桿菌導(dǎo)入重組質(zhì)粒前，應(yīng)用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理使大腸桿菌處于感受態(tài)。
（3）若實(shí)驗(yàn)過程中該興趣小組的同學(xué)采用限制酶BamHⅠ對(duì)目的基因和質(zhì)粒進(jìn)行切割，經(jīng)檢測(cè)，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中木乃伊基因不能正確表達(dá)，其最可能的原因是

同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因與質(zhì)粒反向連接

同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因與質(zhì)粒反向連接

。為有效解決此類問題，措施是

改造目的基因與質(zhì)粒，使其兩端形成不同的酶切位點(diǎn)，滿足雙酶切需要，構(gòu)建表達(dá)載體

改造目的基因與質(zhì)粒，使其兩端形成不同的酶切位點(diǎn)，滿足雙酶切需要，構(gòu)建表達(dá)載體

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