蜂毒肽又稱蜂毒溶血肽，是蜂毒的主要活性成分之一，在抗菌、消炎、抗腫瘤乃至肌肉再生等方面具有一定應(yīng)用價值。蜂毒前溶血肱原是prepromelittin基因（以下簡稱PL基因）的表達(dá)產(chǎn)物，在蜜蜂體內(nèi)合成后首先加工成蜂毒溶血肽原（蜂毒肽前體蛋白），其可被進(jìn)一步水解而形成蜂毒肽。與蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對細(xì)胞的破壞能力小，可以考慮利用基因工程方法在體外合成蜂毒肽的前體產(chǎn)物。
（1）生產(chǎn)蜂毒肽常選用微生物做受體細(xì)胞，優(yōu)點是 微生物生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡單，生長繁殖快、對環(huán)境因素敏感和容易進(jìn)行遺傳物質(zhì)操作微生物生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡單，生長繁殖快、對環(huán)境因素敏感和容易進(jìn)行遺傳物質(zhì)操作；通過原核細(xì)胞 不能不能（填“能”或“不能”）直接獲得蜂毒肽嗎，原因是 原核細(xì)胞無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，無法對表達(dá)出的蜂毒前溶血肽原進(jìn)行加工原核細(xì)胞無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，無法對表達(dá)出的蜂毒前溶血肽原進(jìn)行加工。
（2）為了解決（1）中的問題，對蜂毒前溶血肽原基因進(jìn)行改造（如圖1），以便于后期用羥胺（一種能專一性裂解特定兩個氨基酸之間肽鍵的化合物）對生產(chǎn)出的蜂毒前溶血肽原進(jìn)行裂解獲得蜂毒肽。觀察圖1可知，改造后的DNA序列長度為 213213bp,根據(jù)改造前后氨基酸序列的變化推測羥胺的識別位點是 Asn-GlyAsn-Gly，獲得該位點操作是 在蜂毒肽對應(yīng)的核酸序列前加入AAC，使其表達(dá)Asn從而形成Asn?Gly位點在蜂毒肽對應(yīng)的核酸序列前加入AAC，使其表達(dá)Asn從而形成Asn?Gly位點。除此之外，與原DNA序列相比，改造后的序列中刪除了Gly的對應(yīng)序列 GGTGGT，推測刪除的理由是 蜂毒肽末端沒有Gly蜂毒肽末端沒有Gly。
注；圖中所示的“原DNA序列”為蜂毒前溶血肽原的編碼區(qū)序列的編碼鏈，即轉(zhuǎn)錄時所用模板鏈的互補鏈。①甲硫氨酸，縮寫為M，由起始密碼子AUG編碼；②丙氨酸（Asn），縮寫為N；③甘氨酸（Gly），縮寫為G，由密碼子GGU、GGC、GGA、GGG編碼。
（3）根據(jù)改造后的基因序列，利用人工化學(xué)合成方法進(jìn)行全基因合成，設(shè)計并合成引物對合成基因進(jìn)行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體利用 EcoRI、SalI和DNA連接EcoRI、SalI和DNA連接酶進(jìn)行基因表示載體的構(gòu)建，獲得蜂毒前溶血肽原與GST（一種標(biāo)簽蛋白）融合表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel（見圖2）。已知擴增PL基因時設(shè)計的一條引物的序列是：引物M1：5′-GACACGAATTC-3′，已知EcoRⅠ的識別序列是GAATTC，請續(xù)寫出該引物的后8個堿基 5'-ATGAAATT-3'5'-ATGAAATT-3'。
【答案】微生物生理結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)簡單，生長繁殖快、對環(huán)境因素敏感和容易進(jìn)行遺傳物質(zhì)操作；不能；原核細(xì)胞無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，無法對表達(dá)出的蜂毒前溶血肽原進(jìn)行加工；213；Asn-Gly；在蜂毒肽對應(yīng)的核酸序列前加入AAC，使其表達(dá)Asn從而形成Asn?Gly位點；GGT；蜂毒肽末端沒有Gly；EcoRI、SalI和DNA連接；5'-ATGAAATT-3'
【解答】
【點評】
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發(fā)布：2024/6/27 10:35:59組卷：38引用：3難度：0.6
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1．學(xué)習(xí)以下材料，回答（1）～（4）題。
利用抑制性tRNA進(jìn)行無義突變遺傳病的治療
無義突變是由于某個堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子（UAA、UAG或UGA），從而使肽鏈合成提前終止，造成蛋白質(zhì)的功能改變，引發(fā)相關(guān)疾病。約有10%～15%的人類基因相關(guān)遺傳疾病是由無義突變引發(fā)的。常規(guī)的基因治療是將正?；虻腸DNA序列或是有治療價值的基因（如CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯工具）通過一定的方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)，達(dá)到替代或修復(fù)缺陷基因、治療疾病的目的。導(dǎo)入基因插入位置不當(dāng)、過高或過低表達(dá)，都可能會導(dǎo)致副作用。盡管基因編輯可以實現(xiàn)生理水平的基因表達(dá)，但基因編輯工具引入外源蛋白可能引發(fā)強烈的免疫反應(yīng)仍然是巨大的挑戰(zhàn)。
抑制性tRNA（sup-tRNA）由天然tRNA改造而來，它的反密碼子通過堿基配對原則可以識別無義突變的終止密碼子，使得mRNA在翻譯至無義突變位點時不啟動翻譯終止而是繼續(xù)向后進(jìn)行翻譯，獲得有功能的全長蛋白。
I型黏多糖貯積癥的病因，是相關(guān)基因發(fā)生無義突變，產(chǎn)生終止密碼子UAG。研究者構(gòu)建小鼠該突變基因mldua和Flag基因融合的載體（圖1），以及針對該無義突變設(shè)計的sup-tRNA表達(dá)載體（產(chǎn)生的sup-tRNA能夠識別UAG并攜帶酪氨酸Tyr,簡寫作sup-tRNATyr），將其導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與具有相似作用的化合物G418比較，sup--tRNA的作用更加顯著（圖2）；進(jìn)一步利用重組腺相關(guān)病毒作為載體將sup-tRNA導(dǎo)入患病小鼠模型中，實驗顯示能夠降低黏多糖過度積存，實現(xiàn)對該病癥的有效治療，其療效可以持續(xù)半年以上。
從整體來看，G418在促進(jìn)跨越無義突變位點繼續(xù)翻譯時引入的氨基酸較為隨機，而sup-tRNA引入的氨基酸較為單一，且不會影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，所以sup-tRNA在個體治療中具有很高的安全性，因而在未來基因突變引起的疾病相關(guān)治療中具有非常大的應(yīng)用前景。
（1）侵染時，作為載體的重組腺相關(guān)病毒與靶細(xì)胞膜上的發(fā)生識別，引發(fā)內(nèi)吞，進(jìn)入細(xì)胞后釋放單鏈DNA作為模板，利用宿主細(xì)胞的催化合成其互補DNA鏈，再經(jīng)過過程產(chǎn)生sup-tRNA。
（2）除了引入的氨基酸較為單一，不影響內(nèi)源tRNA穩(wěn)態(tài)，我們還可推斷，用于治療的sup-tRNA在正常終止密碼子處（填“能”或“不能”）繼續(xù)往后翻譯，具有很高的安全性。
（3）研究者構(gòu)建mldua突變基因和Flag基因融合的載體，目的是通過檢測來確定是否跨越無義突變位點繼續(xù)向后翻譯。實驗結(jié)果表明，相比于化合物G418，sup-tRNA在促進(jìn)無義突變位點的翻譯方面更加有效，支持這一結(jié)論的依據(jù)是：。
（4）有文獻(xiàn)報道，已在近1000個不同的人類基因中發(fā)現(xiàn)了7500多個無義突變。常規(guī)的基因治療需要為每種疾病設(shè)計獨特的治療策略，這將是一項耗費驚人的項目。據(jù)此說明sup-tRNA的應(yīng)用價值。發(fā)布：2025/1/3 8:0:1組卷：26引用：1難度：0.6 -
2．人類基因組計劃測定了人體的24條染色體，這24條染色體是（ ?。?/h2>
發(fā)布：2024/12/31 0:30:1組卷：112引用：7難度：0.7 -
3．幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，自然界有些植物能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶催化幾丁質(zhì)水解從而抵抗真菌感染。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入沒有抗性的植物體內(nèi)，可增強其抗真菌的能力。如圖表示為獲取幾丁質(zhì)酶基因而建立cDNA文庫的過程。
（1）圖示以mRNA為材料通過法獲得cDNA，該方法依據(jù)的原理是，通過這種方法獲得的基因中因缺乏和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致將其直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中不能復(fù)制和表達(dá)。
（2）與選用老葉相比，選用嫩葉更容易提取到mRNA，原因是，且提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是。
（3）將從cDNA文庫中獲得的幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體用酶和DNA連接處理后連接起來，構(gòu)建基因表達(dá)載體，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是。發(fā)布：2025/1/5 8:0:1組卷：5引用：1難度：0.7
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