定點(diǎn)誘變技術(shù)是近年來生物工程研究中發(fā)展迅速的一個(gè)領(lǐng)域。通過定點(diǎn)誘變可以在體外改造目的DNA分子，進(jìn)而研究基因的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。經(jīng)典的大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)成為基于PCR的定點(diǎn)誘變技術(shù)中應(yīng)用最普遍的方法，操作過程如圖甲。研究者欲改造某基因并將其導(dǎo)入大腸桿菌的質(zhì)粒中保存，該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)如圖乙?；卮鹣铝袉栴}：

（1）利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR（PCR1和PCR2），在PCR1中，至少需要

2

2

個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板。在PCR2中，要獲得帶有誘變點(diǎn)的改良基因，引物應(yīng)選用大引物兩條鏈中的

②

②

（填“①”或“②”）。
（2）為實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒和改良基因的高效連接，選用限制酶XmaⅠ而不選用限制酶SmaⅠ的原因是

SmaⅠ的酶切末端為平末端，無法與改良基因上的黏性末端連接

SmaⅠ的酶切末端為平末端，無法與改良基因上的黏性末端連接

。為將改良基因構(gòu)建在質(zhì)粒上，還需要

BgiⅡ、DNA連接酶

BgiⅡ、DNA連接酶

等酶。
（3）在構(gòu)建改良基因表達(dá)載體時(shí)，有的質(zhì)粒含有改良基因，有的質(zhì)粒為空白質(zhì)粒，將含上述元件的溶液加入到大腸桿菌菌液中，適宜溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間后，再將菌液涂布在含氨芐青霉素和

β-半乳糖苷

β-半乳糖苷

的平板上。一段時(shí)間后，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)白色和藍(lán)色兩種菌落，其中白色菌落含有重組質(zhì)粒，判斷的依據(jù)是

構(gòu)建改良基因重組質(zhì)粒時(shí)破壞了LacZ基因，含該質(zhì)粒的大腸桿菌不能分解β-半乳糖苷產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，菌落為白色

構(gòu)建改良基因重組質(zhì)粒時(shí)破壞了LacZ基因，含該質(zhì)粒的大腸桿菌不能分解β-半乳糖苷產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，菌落為白色

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