環(huán)狀定點誘變技術通過設計特定引物進行PCR，來實現目標載體的單堿基突變，從而生產出滿足需求的質粒載體。質粒 pUC18中含有限制酶 Eam1105Ⅰ（識別序列為5'-GACGGGAGTC-3'）和EcoRⅠ的識別序列。為使質粒pUC18不能被限制酶Eam1105Ⅰ識別，但依然具有氨芐青霉素抗性，現對質粒pUC18第1695個堿基（圖方框中的堿基）進行誘變，設計了具有誘變位點的引物P1和不具有誘變位點的引物P₂。具體操作流程如圖所示。

（1）為使誘變后的質粒不能被限制酶 Eaml105Ⅰ識別，但依然具有氨芐青霉素抗性，選擇質粒突變位點時應注意

誘變的位點位于限制酶Eam1105Ⅰ識別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達

誘變的位點位于限制酶Eam1105Ⅰ識別序列中，誘變后編碼的氨基酸不變或不影響氨芐青霉素基因的正常表達

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（2）進行上述PCR反應，緩沖液中需提供pUC18質粒，P₁、P₂兩種引物以及

耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸

耐高溫DNA聚合酶、四種脫氧核苷酸

，同時通過控制溫度使DNA復制在體外反復進行。至少經過

2

2

個循環(huán)，會出現雙鏈均被誘變的線性質粒。擴增得到的線性質粒需在

T₄DNA連接

T₄DNA連接

酶的作用下才能連接成環(huán)狀質粒。
（3）提取連接產物（環(huán)化后的質粒），經過 EcoRⅠ、Eaml105Ⅰ雙酶切，然后進行電泳，可根據結果判斷質粒pUC18的第1695個堿基誘變是否成功，判斷的理由是

誘變后質粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質粒會出現2條條帶

誘變后質粒的電泳圖譜中只有1條條帶，未誘變質粒會出現2條條帶

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