為擴大可耕地面積，增加糧食產量，沿海灘涂鹽堿地的開發(fā)利用備受關注?？茖W家應用耐鹽堿基因培育出了耐鹽堿水稻新品系，為解決我國糧食問題做出了重要貢獻。若測得某耐鹽基因（RST1）編碼鏈首端到末端（其中一條鏈）的序列為5'-ATCTACGCGCTCATCCG...（省略3n個核苷酸序列）…CGCAGCAATGAGTAGCG-3'。如圖1為構建重組質粒的過程示意圖，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ為限制酶（四種酶的識別序列詳見表）。請回答下列問題：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	SmaⅠ	Sau3AⅠ
識別序列及切割位點（5′→3′）	G↓GATCC	T↓GATCA	CCC↓GGG	↓GATC

（1）為獲取更多RST1基因，可通過PCR擴增，在反應體系中加入引物的作用是

與目的基因的模板鏈配對（結合），使Taq酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸，延伸子鏈

與目的基因的模板鏈配對（結合），使Taq酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸，延伸子鏈

。某同學設計了如下六種PCR引物，其中可選用的引物是

②④

②④

（選填序號）。
①5'-GACTACTCGCGCATCTA-3'
②5'-ATCTACGCGCTCATCCG-3'
③5'-GCGATGAGTAACGACGC-3'
④5'-CGCTACTCATTGCTGCG-3'
⑤5'-TAGATGCGCGAGTAGGC-3'
⑥5'-CGCAGCAATGAGTAGCG-3'
（2）若PCR反應未得到任何擴增產物，主要原因有

①②④⑥

①②④⑥

（選填序號）。
①退火溫度過高 ②Taq酶失活 ③設計的引物過短 ④變性溫度過低 ⑤模板受到污染 ⑥Mg²⁺濃度過低
（3）為將圖中質粒A和RST1基因正確連接構建重組質粒B，設計RST1基因的引物時，在兩種引物的5'端分別添加

BamHⅠ、SmaⅠ

BamHⅠ、SmaⅠ

酶的識別序列，選用

BclⅠ、SmaⅠ

BclⅠ、SmaⅠ

酶切割質粒A，酶切后的載體和目的基因片段通過

T₄DNA連接

T₄DNA連接

酶作用后獲得重組質粒。為了篩選出轉入了重組質粒的受體細胞，應首先在篩選平板培養(yǎng)基添加

四環(huán)素

四環(huán)素

，再將平板上長出的菌落通過影印接種法（蓋章）接種到添加

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的平板培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)觀察。
（4）從平板上長出的菌落若提取重組質粒B利用Sau3AI進行酶切，最多可以得到

7

7

種大小不同的DNA片段。
（5）圖2是對重組質粒測序的部分序列，若目的基因與質粒正確連接（啟動子順時針轉錄），則圖中連接處的序列正確的是

Q3

Q3

（填序列編號）。