PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉栴}：
（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的

總RNA

總RNA

，再經(jīng)

逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄

過程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來擴(kuò)增目的基因。與生物體內(nèi)的DNA聚合酶相比，PCR技術(shù)中所用的DNA聚合酶特點(diǎn)是

耐高溫

耐高溫

。
（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，質(zhì)粒DNA含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是

RNA聚合酶

RNA聚合酶

識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)。質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能

準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)制

準(zhǔn)確進(jìn)行復(fù)制

。

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	A↓AGCTT	EcoRⅠ	G↓AATTC
PvitⅡ	CAG↓CTG	PstⅠ	CTGC↓AG
KpnⅠ	G↓GTACC	BamHⅠ	G↓GATCC

注：箭頭表示切割位點(diǎn)
（3）構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶，其中，DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是

磷酸二酯鍵

磷酸二酯鍵

。圖1中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見圖2，為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

EcoRⅠ

EcoRⅠ

和

PvitⅡ

PvitⅡ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用

T₄DNA連接酶

T₄DNA連接酶

（填“E?coliDNA連接酶”或“T₄DNA連接酶”）。
（4）轉(zhuǎn)化前需用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于

感受態(tài)

感受態(tài)

，以提高轉(zhuǎn)化效率。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。