生長素參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，生長素運(yùn)輸?shù)鞍祝≒INI）對LAA的極性運(yùn)輸具有重要作用。為研究35S啟動子（一種來自病毒的強(qiáng)啟動子）能否引起下游基因的過量表達(dá)，研究人員將35S啟動子與PINI基因轉(zhuǎn)入擬南芥，觀察PINI過量表達(dá)對植物的影響。
（1）獲取PINI基因的mRNA后，通過RTPCR擴(kuò)增獲取PINI基因（DNA）時所需要的酶是

逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶

逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶

。每次PCR循環(huán)分為3步，其中所需溫度最低的一步稱為

退火（或復(fù)性）

退火（或復(fù)性）

。
（2）PINI基因不能直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，需要構(gòu)建PINI表達(dá)載體。構(gòu)建PINI表達(dá)載體的目的是

利于PINI基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；利于PINI基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用

利于PINI基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；利于PINI基因在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用

。
（3）為將PINI基因以正確方向插入質(zhì)粒需要雙酶切。在設(shè)計引物時，需在引物的5'端加入相應(yīng)的酶切位點。已知PINI基因的1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，據(jù)圖分析，引物1和引物2的酶切位點分別為

PstI、EcoRI

PstI、EcoRI

，理由是

因PINI基因中含有XhoI，引物上的酶切位點不能為XhoI，1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在啟動子后的方向應(yīng)為3'→5'，因此，引物2應(yīng)位于PINI基因的上游，其上應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點；引物應(yīng)1位于PINI基因的下游，其上應(yīng)構(gòu)建PstI的酶切位點

因PINI基因中含有XhoI，引物上的酶切位點不能為XhoI，1鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，該鏈在啟動子后的方向應(yīng)為3'→5'，因此，引物2應(yīng)位于PINI基因的上游，其上應(yīng)構(gòu)建EcoRI的酶切位點；引物應(yīng)1位于PINI基因的下游，其上應(yīng)構(gòu)建PstI的酶切位點

。

（4）提取轉(zhuǎn)基因擬南芥的DNA，用相應(yīng)引物擴(kuò)增出35S啟動子和PINI基因。為檢測目的基因是否導(dǎo)入擬南芥，應(yīng)電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的

35S啟動子

35S啟動子

，不檢測另一種的原因是

擬南芥細(xì)胞中原本存在PINI基因，檢測PINI基因無法確定外源PINI基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞

擬南芥細(xì)胞中原本存在PINI基因，檢測PINI基因無法確定外源PINI基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞

。也可在個體水平上進(jìn)行檢測，方法是

對轉(zhuǎn)基因擬南芥噴灑適宜濃度的除草劑，觀察能否存活

對轉(zhuǎn)基因擬南芥噴灑適宜濃度的除草劑，觀察能否存活

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