非霍奇金淋巴瘤是一種原發(fā)于淋巴組織的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其細(xì)胞表面高表達(dá)CD19蛋白。CAR-T（嵌合抗原受體T細(xì)胞）療法是利用基因工程的方法使T細(xì)胞表面表達(dá)能夠靶向特定抗原的受體（CAR），改造后的T細(xì)胞被稱為CAR-T，可以識(shí)別并攻擊帶有特定抗原的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激活機(jī)體自身免疫從而達(dá)到抗腫瘤的效果。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）目前制備CAR-T細(xì)胞大多是采用慢病毒感染的方式使T細(xì)胞表達(dá)CAR。
①獲取CAR基因（實(shí)質(zhì)為抗CD19蛋白的抗體基因）：將抗CD19蛋白的抗體基因作為PCR反應(yīng)的模板，并依據(jù)

抗CD19蛋白抗體基因兩端的部分核苷酸序列

抗CD19蛋白抗體基因兩端的部分核苷酸序列

設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增該基因。
②構(gòu)建基因表達(dá)載體：圖1為所用載體示意圖，圖2為限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)。為使目的基因與載體正確連接，在擴(kuò)增目的基因時(shí)，應(yīng)在其一對(duì)引物的

5’

5’

端分別引入

Pvit2、EcoRI

Pvit2、EcoRI

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。在目的基因和載體連接時(shí)，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（選填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：將重組質(zhì)粒通過(guò)

顯微注射

顯微注射

技術(shù)導(dǎo)入到T細(xì)胞。
④重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：將轉(zhuǎn)化后的T細(xì)胞置于含

嘌呤霉素

嘌呤霉素

的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建是否成功。
（2）采用病毒作為遞送載體存在隨機(jī)插入的安全隱患，CRISPR/Cas9技術(shù)作為第三代基因編輯工具（圖3），sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割來(lái)完成基因的編輯?？茖W(xué)家利用該技術(shù)制備的CAR-T細(xì)胞，在非霍奇金淋巴瘤臨床前的治療中取得理想效果。其操作原理如圖4所示。
①sgRNA能與靶基因特異性識(shí)別、結(jié)合的原理是

（sgRNA與靶基因）堿基互補(bǔ)配對(duì)

（sgRNA與靶基因）堿基互補(bǔ)配對(duì)

，基因編輯工具中對(duì)基因進(jìn)行剪切的是

Cas9蛋白

Cas9蛋白

。
②腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1蛋白和T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合，發(fā)出免疫抑制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。該研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)切割T細(xì)胞中PD-1基因的同時(shí)導(dǎo)入靶向PD-1基因的同源重組序列，利用同源重組修復(fù)的原理將

抗CD19蛋白的抗體基因

抗CD19蛋白的抗體基因

重組在PD-1基因內(nèi)部，制備了非病毒定點(diǎn)整合的CAR-T細(xì)胞，如圖4。
③綜合上述信息分析，與慢病毒制備的CAR-T細(xì)胞相比，該方案制備的CAR-T細(xì)胞在非霍奇金淋巴瘤的治療中的優(yōu)點(diǎn)有：可以

定向

定向

插入抗CD19蛋白的抗體基因，降低隨機(jī)插入的安全隱患，提高CAR-T細(xì)胞的安全性；可以使PD-1基因突變，降低腫瘤細(xì)胞

免疫逃逸

免疫逃逸

的可能性，提高CAR-T細(xì)胞的有效性。