血栓對健康有極大危害。來源于金黃色葡萄球菌的天然葡激酶（SAK）是一種新型溶栓制劑，因易誘發(fā)免疫反應(yīng)而嚴(yán)重限制了應(yīng)用。人HC蛋白參與免疫抑制反應(yīng)，對機(jī)體保護(hù)性的免疫調(diào)節(jié)有著重要作用。研究人員預(yù)測，將SAK與人HC蛋白融合形成的SAK-HC融合蛋白不僅能夠發(fā)揮高效溶栓作用，且能降低機(jī)體免疫系統(tǒng)對葡激酶的反應(yīng)，這將具有極大的臨床應(yīng)用前景。
（1）獲取SAK-HC融合基因。設(shè)計引物分別擴(kuò)增SAK基因和HC基因，其中HC基因的引物D中增加了一段與SAK基因相同的序列。SAK基因擴(kuò)增時引物（F和N）位置如圖1所示，請在方框內(nèi)繪制出HC基因擴(kuò)增的引物（D和R）位置。將得到的SAK基因和HC基因1：1混合，經(jīng)再次擴(kuò)增即可得到SAK-HC融合基因。
（2）利用

限制酶和DNA連接

限制酶和DNA連接

酶將融合基因與質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化經(jīng)

Ca²⁺

Ca²⁺

處理的大腸桿菌。篩選、培養(yǎng)大腸桿菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳分析（圖2），結(jié)果顯示融合基因已成功導(dǎo)入大腸桿菌，理由是

轉(zhuǎn)基因大腸桿菌提取出的質(zhì)粒經(jīng)酶切后的電泳結(jié)果中存在與融合基因PCR的電泳結(jié)果相同的片段

轉(zhuǎn)基因大腸桿菌提取出的質(zhì)粒經(jīng)酶切后的電泳結(jié)果中存在與融合基因PCR的電泳結(jié)果相同的片段

，為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，還應(yīng)對重組質(zhì)粒酶切的產(chǎn)物進(jìn)行

DNA測序

DNA測序

。
（3）培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌一段時間后，破裂細(xì)胞、提取純化融合蛋白并用緩沖液稀釋，進(jìn)行活性鑒定。培養(yǎng)基中加入纖維蛋白原、纖溶酶原、凝血酶等模擬血栓形成，搖勻至渾濁立即倒平板，用打孔器在冷卻的平板上打加樣孔，并加入不同的樣品，結(jié)果如圖3。據(jù)圖判斷，表中a、b分別是

SAK-HC融合蛋白

SAK-HC融合蛋白

、

樣品稀釋緩沖液

樣品稀釋緩沖液

。一段時間后測量培養(yǎng)基上

透明圈直徑大小

透明圈直徑大小

，由結(jié)果可知

融合蛋白與傳統(tǒng)溶栓藥物尿激酶及其他方式改造的葡激酶的活性相當(dāng)

融合蛋白與傳統(tǒng)溶栓藥物尿激酶及其他方式改造的葡激酶的活性相當(dāng)

，說明融合蛋白具有進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究的價值。

加樣孔	樣品	劑量
1	傳統(tǒng)溶栓藥物尿激酶	10μL
2	傳統(tǒng)溶栓藥物尿激酶	20μL
3	a	10μL
4	a	20μL
5	其他方式改造的葡激酶	10μL
6	其他方式改造的葡激酶	20μL
7	b	20μL

（4）研究發(fā)現(xiàn)，葡激酶結(jié)構(gòu)中的第77位精氨酸與T細(xì)胞對其識別有關(guān)。請設(shè)想新的研究思路改造現(xiàn)有葡激酶，以降低免疫反應(yīng)，使其適于臨床應(yīng)用，寫出基本流程

設(shè)計葡激酶的第77位精氨酸替換為其它氨基酸→根據(jù)新的葡激酶氨基酸序列推測葡激酶基因的堿基序列→改造或合成新的葡激酶基因→將新的葡激酶基因通過基因工程轉(zhuǎn)化大腸桿菌→獲得新型葡激酶

設(shè)計葡激酶的第77位精氨酸替換為其它氨基酸→根據(jù)新的葡激酶氨基酸序列推測葡激酶基因的堿基序列→改造或合成新的葡激酶基因→將新的葡激酶基因通過基因工程轉(zhuǎn)化大腸桿菌→獲得新型葡激酶

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