PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0.9kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白。回答下列問(wèn)題：
相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（注：箭頭表示切割位點(diǎn)）

名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)	名稱	識(shí)別序列及切割位點(diǎn)
HindⅢ	A↓AGCTT TTCGA↑A	EcoRⅠ	G↓AATTCCTTAA↑G
PvitⅡ	CAG↓CTGGTC↑GAC	PstⅠ	CTGC↓AG GA↑CGTC
KpnⅠ	G↓GTACCCCATG↑G	BamHⅠ	G↓GATCCCCTAG↑G

（1）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

EcoRⅠ和

EcoRⅠ和

和

PvitⅠ

PvitⅠ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。對(duì)于酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接，選擇兩種限制酶切比用一種限制酶切好的原因：

可以防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可以防止目的基因和質(zhì)粒的反向連接

可以防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可以防止目的基因和質(zhì)粒的反向連接

。

注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0.2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中
（2）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，結(jié)果如圖2，

3

3

號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。
（3）根據(jù)PHB2cDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物如圖，通過(guò)PCR擴(kuò)增PHB2基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為

引物1和引物4

引物1和引物4

，pcr擴(kuò)增時(shí)選取的DNA往往類似于圖，而目的基因往往只是其中的一個(gè)片段類似于AB段，當(dāng)pcr擴(kuò)增至第四輪循環(huán)時(shí)等長(zhǎng)的目的基因片段占

1

2

1

2

。