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Gateway克隆技術(shù)是一種快速,高效地構(gòu)建基因表達(dá)載體的方法。這種方法基于噬菌體可以和大腸桿菌DNA的特定位點(diǎn)發(fā)生互換的特點(diǎn)設(shè)計(jì),不用依賴限制酶,而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和克隆酶,將目的基因克隆到其它的受體載體上。如圖1所示,Gateway克隆技術(shù)依賴于BP反應(yīng)和LR反應(yīng),通過BP反應(yīng)將目的基因連接到質(zhì)粒1上,獲得克隆質(zhì)粒2,再通過LR反應(yīng)將目的基因連接到載體質(zhì)粒3上,獲得表達(dá)載體。請(qǐng)回答下列問題:
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(1)構(gòu)建的基因表達(dá)載體除含有圖示的目的基因和標(biāo)記基因外,還必須有
啟動(dòng)子和終止子
啟動(dòng)子和終止子
。
(2)為構(gòu)建基因表達(dá)載體,需先設(shè)計(jì)引物,通過PC特異性擴(kuò)增目的基因,用于擴(kuò)增目的基因的引物需滿足的條件是
能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)
能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)
,為使PCR產(chǎn)物能參與后續(xù)交換,需要分別在2種引物上添加相應(yīng)的attB1和attB2序列,該序列應(yīng)添加在引物的
5′端
5′端
(填3′端”或5′端”)。
(3)BP反應(yīng)中,將帶有atB1和attB2序列的目的基因與質(zhì)粒1混合,加入BP克隆酶,atB和attP位點(diǎn)之間會(huì)發(fā)生互換。該反應(yīng)體系中可能含有未交換的質(zhì)粒1和交換后的質(zhì)粒2,為從體系中篩選出質(zhì)粒2,用混合體系中的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化用Ca2+處理后的大腸桿菌,并涂布到含有青霉素的平板上。理論上,在平板上長(zhǎng)出菌落的大腸桿菌中含有的質(zhì)粒即為質(zhì)粒2,理由是
質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因,導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖;而質(zhì)粒1含有ccdB基因,其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖
質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因,導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖;而質(zhì)粒1含有ccdB基因,其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖
。
(4)除本題所用接種方法外,也可以采用
平板劃線
平板劃線
法進(jìn)行接種,若培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示,接種環(huán)節(jié)需灼燒接種環(huán)
5
5
次。
(5)若將(3)中獲得的含質(zhì)粒2的大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),從物理性質(zhì)考慮,一般采用
液體
液體
培養(yǎng)基。

【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合
【答案】啟動(dòng)子和終止子;能與目的基因兩端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì);5′端;質(zhì)粒2含有青霉素抗性基因且不具有ccdB基因,導(dǎo)入該質(zhì)粒的大腸桿菌能在含青霉素的平板上增殖;而質(zhì)粒1含有ccdB基因,其表達(dá)的產(chǎn)物能抑制大腸桿菌的增殖;平板劃線;5;液體
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布:2024/6/27 10:35:59組卷:17引用:3難度:0.6
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    發(fā)布:2024/12/20 5:0:2組卷:35引用:5難度:0.6
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    (1)獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中應(yīng)用的生物技術(shù)有
     
    (答出2項(xiàng))等。
    (2)為確保目的基因定向插入了質(zhì)粒,應(yīng)該選擇
     
    (填酶)切割目的基因和質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中加入
     
    (填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”)對(duì)目的基因進(jìn)行篩選。
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    (填序號(hào))。過程②③采用的方法是
     

    (4)⑤過程需要用到
     
    等植物激素,在誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗的過程中,這兩種植物激素的比例會(huì)發(fā)生變化,原因是
     
    。

    發(fā)布:2024/12/20 2:30:1組卷:16引用:5難度:0.5
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    識(shí)別序列及切割位點(diǎn) G↓CATCC G↓AATTC A↓AGCTT G↓CTAGC C↓AATTG
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    發(fā)布:2024/12/20 3:30:1組卷:6引用:1難度:0.6
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