研究者將某基因改造并插入質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入大腸桿菌中獲得表達(dá)產(chǎn)物。將獲得的突變基因?qū)肫胀ù竽c桿菌之前，先構(gòu)建基因表達(dá)載體。如圖1為所用載體示意圖，表為限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)。如圖2為通過PCR定點(diǎn)誘變改造基因的流程圖。請回答下列問題：

（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，為使目的基因與載體正確連接，在擴(kuò)增目的基因時(shí)，應(yīng)在其一對引物的5'端分別引入

Pvit2、ECORⅠ

Pvit2、ECORⅠ

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。在目的基因和載體連接時(shí)，可選用

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶

（填“E?coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
（2）構(gòu)建的基因表達(dá)載體中需要使用大腸桿菌蛋白基因的啟動(dòng)子tac,原因是

需要用大腸桿菌蛋白基因的啟動(dòng)子，使目的基因在大腸桿菌內(nèi)特異性表達(dá)

需要用大腸桿菌蛋白基因的啟動(dòng)子，使目的基因在大腸桿菌內(nèi)特異性表達(dá)

。將受體菌置于含有

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以獲得能表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)菌。
（3）利用大引物PCR進(jìn)行定點(diǎn)誘變需要進(jìn)行兩輪PCR，PCR過程中需要

耐高溫的DNA聚合

耐高溫的DNA聚合

酶。在第一次PCR中，至少需要

2

2

個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板。利用所獲得的大引物模板和其他引物進(jìn)行第二次PCR過程，要獲得帶有誘變點(diǎn)的改良基因，引物應(yīng)選用大引物兩條鏈中的

②

②

（填“①”或“②”）。與X射線誘變相比，該突變技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是

目的性強(qiáng)、定向突變、突變頻率高等

目的性強(qiáng)、定向突變、突變頻率高等

。