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纖維素酶的分子改造
纖維素酶的分子改造先后經(jīng)歷了以下3個(gè)階段:以定點(diǎn)突變?yōu)榛A(chǔ)的“定點(diǎn)理性設(shè)計(jì)”;以易錯(cuò)PCR等技術(shù)主導(dǎo)的“定向跡化”;以數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)或結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)指導(dǎo)的“構(gòu)理性設(shè)計(jì)”。
20世紀(jì)80年代,隨著定點(diǎn)突變技術(shù)的快速發(fā)展,纖維素酶理性改變策略應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)的基本思路是:先研究分析纖維素酶的三維結(jié)構(gòu)信息,再基于對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解,選定特定的氨基酸進(jìn)行改造,找到并改變相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)。常用的定點(diǎn)突變技術(shù)是重疊延伸PCR(過程如圖1),可對(duì)目的基因特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)替提、缺失或者插入,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的改造。
然而,目前僅獲得了纖維素酶家族的少數(shù)成員三維結(jié)構(gòu),通過定點(diǎn)突變?yōu)榇睦硇栽O(shè)計(jì)進(jìn)行纖維素酶分子的改造在短期內(nèi)仍難以獲得廣泛的成效。因此,采用“非理性”設(shè)計(jì)就成為一種重要的研究手段。所謂“非理性”設(shè)計(jì),即定向進(jìn)化,就是在對(duì)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制不是很清楚的條件下,模擬自然進(jìn)化過程,利用易錯(cuò)PCR等技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行隨機(jī)突變,提高基因突變頻率和基因突變的多樣性,并與定向篩選策略結(jié)合,最終獲得具有某些優(yōu)良特性的酶分子(過程如圖2)。
盡管定向進(jìn)化技術(shù)在對(duì)纖維素酶進(jìn)行改造時(shí)可能會(huì)得到意想不到的“有益收獲”,但由于對(duì)要改造的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息并不清楚,因此操作起來具有明顯的“盲目性”。
近十年隨著計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力大幅提升以及先進(jìn)算法不斷涌現(xiàn),計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)改造得到了較大的重視和發(fā)展,形成了“構(gòu)理性設(shè)計(jì)”的新策略。這一策略借助蛋白質(zhì)保守位點(diǎn)及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)分析,通過非隨機(jī)的方式選取若干個(gè)氨基酸位點(diǎn)作為改造點(diǎn),并結(jié)合有效密碼子的理性選用。構(gòu)建“小而精”的突變體文庫。與定向進(jìn)化相比,“結(jié)構(gòu)理性設(shè)計(jì)”可提供明確的改造方案,大幅降低建立、篩選突變體文庫所需的工搾量,增大理性設(shè)計(jì)成功的概率。
(1)纖維素酶的分子改造過程屬于蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)工程。
(2)根據(jù)圖1所示的疊延伸PCR過程,回答下列問題。
①PCR擴(kuò)增DNA的過程中,引物a、b、c、d中,PCR1應(yīng)選擇引物a和ba和b,PCR2應(yīng)選擇引物c和dc和d,重疊延伸時(shí)應(yīng)選擇引物a和da和d。
②重疊延伸PCR通過在引物b和c上引入突變在引物b和c上引入突變實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變,引物b和c上的突變位點(diǎn)的堿基應(yīng)互補(bǔ)配對(duì)互補(bǔ)配對(duì)。PCR1和PCR2需要分別進(jìn)行的原因是引物b和引物c可以互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致引物失效引物b和引物c可以互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致引物失效。
(3)請(qǐng)據(jù)圖2寫出用定向進(jìn)化策略改造纖維素酶的操作過程:利用易錯(cuò)PCR等技術(shù)對(duì)纖維素基因進(jìn)行隨機(jī)突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構(gòu)建基因表達(dá)載體→將突變纖維素酶基因(重組表達(dá)載體)導(dǎo)入大腸桿菌(受體細(xì)胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定利用易錯(cuò)PCR等技術(shù)對(duì)纖維素基因進(jìn)行隨機(jī)突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構(gòu)建基因表達(dá)載體→將突變纖維素酶基因(重組表達(dá)載體)導(dǎo)入大腸桿菌(受體細(xì)胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定。
(4)用定向進(jìn)化策略改造纖維素酶,下列哪些說法正確ACDEACDE。
A.定向進(jìn)化策略可以使纖維素酶朝著人們需要的方向進(jìn)化
B.定向進(jìn)化策略獲得的纖維素酶的基因序列在篩選前是已知的
C.定向進(jìn)化策略的實(shí)質(zhì)是達(dá)爾文進(jìn)化論在分子水平上的延伸和應(yīng)用
D.與定點(diǎn)誘變相比,定向進(jìn)化策略不需解析酶的結(jié)構(gòu)和功能,更接近自然進(jìn)化過程
E.基因工程技術(shù)是定向進(jìn)化策略改造纖維素的基礎(chǔ)
(5)有人認(rèn)為,以數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)或結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)指導(dǎo)的“結(jié)構(gòu)理性設(shè)計(jì)”必將成為纖維素酶的分子改造的主流方向,該說法是否正確,請(qǐng)結(jié)合本文作出判斷,并撰寫一段文字,向公眾進(jìn)行科學(xué)解釋。
【考點(diǎn)】DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定.
【答案】蛋白質(zhì);a和b;c和d;a和d;在引物b和c上引入突變;互補(bǔ)配對(duì);引物b和引物c可以互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致引物失效;利用易錯(cuò)PCR等技術(shù)對(duì)纖維素基因進(jìn)行隨機(jī)突變→將突變纖維素酶基因與載體相連,構(gòu)建基因表達(dá)載體→將突變纖維素酶基因(重組表達(dá)載體)導(dǎo)入大腸桿菌(受體細(xì)胞)→具有某些優(yōu)良特性的酶的篩選與鑒定;ACDE
【解答】
【點(diǎn)評(píng)】
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發(fā)布:2024/6/27 10:35:59組卷:37引用:1難度:0.6
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1.科研人員克隆了豬白細(xì)胞抗原基因(SLA-2基因),構(gòu)建了該基因的真核表達(dá)載體,進(jìn)行了豬腎上皮細(xì)胞表達(dá)研究。實(shí)驗(yàn)的主要流程如圖1,SLA-2基因長度為1100bp,質(zhì)粒B的總長度為4445bp,其限制酶切點(diǎn)后的數(shù)字表示距復(fù)制原點(diǎn)的距離。請(qǐng)回答:
限制酶 BclⅠ NotⅠ XbaⅠ San3AⅠ 識(shí)別序列及切割位點(diǎn) T↓GATCA GC↓GGCCGC T↓CTAGA ↓GATC
a 5'-GCTCTAGAATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
b 5'-GTTGCGGCCGCTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
c 5'-GCGATCATGCGGGTCAGGGGCCCTCAAGCCATCCTC
d 5'-GTTTGATCACTCACACTCTAGGATCCTTGGTAAGGGACAC
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