家禽體內缺少能降解纖維素的酶，影響了家禽對谷物飼料中纖維素的吸收和利用?？蒲腥藛T將W基因（編碼一種降解纖維素的酶）導入乳酸桿菌細胞內，再將其添加到谷物飼料中，以提高家禽對纖維素的利用。回答下列問題。
（1）家禽的胃腸道菌群中，乳酸桿菌占一定的優(yōu)勢，其細胞呼吸產生的乳酸等可抑制家禽胃腸道中有害細菌的生長和繁殖，維持腸道的正常機能，這體現(xiàn)了乳酸桿菌和家禽間

互利共生

互利共生

的種間關系。
（2）如圖1是從枯草芽孢桿菌細胞克隆得到的含W基因的DNA片段，其中乙鏈是轉錄模板鏈；圖2是所用的質粒載體。表中EcoRⅠ、BamHⅠ、KpmⅠ、MfeⅠ、HindⅢ是限制酶及其切割位點（均形成黏性末端）。

限制酶	EcoRⅠ	BamHⅠ	KpmⅠ	MfeⅠ	HindⅢ
識別序列及其切割位點	5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′	5′-G↓GATCC-3 3′CCTAG↓G-5	5′-GGTAC↓C-3 3′-C↑CATGG-5	5′-C↓AATTG-3 3′-GTTAA↑C-5	5′A↓AGCTT-3′ 3′-TTCGA↑A-5′

①為使W基因在乳酸桿菌中表達，構建基因表達載體時，切割含W基因的DNA片段需選用EcoRⅠ和HindⅢ限制酶，切割質粒的限制酶需選用

MfeⅠ

MfeⅠ

（填“KpnⅠ”或“MfeⅠ”）和HindⅢ，再通過DNA連接酶能將W基因與質粒進行拼接成重組質粒，說明除HindⅢ外，所選限制酶應要滿足的條件是

a.不能破壞目的基因；b.目的基因首尾都要有切點；c.質粒要確保至少含有一個完整的標記基因；d.質粒上的切點要位于啟動子之后、終止子之前；e.目的基因和質粒切割后形成的粘性末端還要能互補配對

a.不能破壞目的基因；b.目的基因首尾都要有切點；c.質粒要確保至少含有一個完整的標記基因；d.質粒上的切點要位于啟動子之后、終止子之前；e.目的基因和質粒切割后形成的粘性末端還要能互補配對

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②將所得的重組質粒轉化乳酸桿菌后，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選，得到的乳酸桿菌還需進行分子水平檢測是否導入了W基因，原因是

構建的基因表達載體只含有標記基因氨芐青霉素抗性基因，所以應使用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選

構建的基因表達載體只含有標記基因氨芐青霉素抗性基因，所以應使用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選

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（3）對導入重組質粒的乳酸桿菌還需進行個體生物學水平的檢測，以確定目的基因（W基因）是否起作用。檢測過程如下：
①配制固體鑒定培養(yǎng)基：除加入水、無機鹽、剛果紅、維生素、氮源、瓊脂外，還需要添

纖維素

纖維素

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②將培養(yǎng)的乳酸桿菌、

導入空質粒的乳酸菌

導入空質粒的乳酸菌

和導入了重組質粒的乳酸桿菌菌液分別接種于固體鑒定培養(yǎng)基上（編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組）。其中Ⅱ組的目的是

排除質粒自身的影響

排除質粒自身的影響

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③觀察結果：只有導入了重組質粒的乳酸桿菌在此培養(yǎng)基上出現(xiàn)了

以菌落為中心的透明圈

以菌落為中心的透明圈

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