基因敲減主要是指從轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平使基因表達(dá)失活的技術(shù)，其中RNA干擾技術(shù)是常用的基因敲減技術(shù)，該技術(shù)首先要根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)出反義RNA和正義RNA構(gòu)建成雙鏈RNA（shRNA），然后用相關(guān)酶切割shRNA形成反義RNA片段，其可與目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而誘導(dǎo)相關(guān)酶水解mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的敲減。為檢測(cè)設(shè)計(jì)出的shRNA是否能成功敲減基因還需要利用熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。如圖1表示敲減載體構(gòu)建，圖2表示熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)檢測(cè)的原理。

（1）據(jù)圖1分析，若要從含shRNA基因的DNA分子中擴(kuò)增出shRNA基因并能使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要用到的引物是

引物2、引物5

引物2、引物5

，為使擴(kuò)增出的shRNA基因能夠和質(zhì)粒構(gòu)建敲減載體，在設(shè)計(jì)引物時(shí)需在引物的

5'

5'

（填5'或3'）端分別添加

BamHⅠ、HindⅢ

BamHⅠ、HindⅢ

酶能夠識(shí)別的序列。
（2）已知mRNA末端缺失會(huì)導(dǎo)致mRNA水解。熒光酶報(bào)道基因與欲敲減的目的基因串聯(lián)可構(gòu)成熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)，熒光酶報(bào)道基因與目的基因的連接點(diǎn)是終止密碼子對(duì)應(yīng)的序列，而不是終止子，其原因是

轉(zhuǎn)錄過(guò)程在終止子處會(huì)終止，若連接點(diǎn)為終止密碼子對(duì)應(yīng)的序列則不能實(shí)現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)

轉(zhuǎn)錄過(guò)程在終止子處會(huì)終止，若連接點(diǎn)為終止密碼子對(duì)應(yīng)的序列則不能實(shí)現(xiàn)兩基因的mRNA的串聯(lián)

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（3）熒光酶報(bào)道基因系統(tǒng)與敲減載體一同導(dǎo)入受體細(xì)胞中可以根據(jù)熒光的有無(wú)檢測(cè)敲減載體是否成功，其機(jī)理是

若敲減載體能夠敲除目的基因，則熒光酶報(bào)道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會(huì)被水解，熒光酶報(bào)道基因不能正常表達(dá)，無(wú)法檢測(cè)到熒光出現(xiàn)

若敲減載體能夠敲除目的基因，則熒光酶報(bào)道基因和目的基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA會(huì)被水解，熒光酶報(bào)道基因不能正常表達(dá)，無(wú)法檢測(cè)到熒光出現(xiàn)

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