人類γ基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn),該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后,γ基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列,解除對γ基因表達(dá)的抑制,可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療??蒲腥藛T擴(kuò)增了γ基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置。相關(guān)信息如圖所示。
(1)圖中啟動子是 RNA聚合酶RNA聚合酶識別和結(jié)合位點(diǎn),且啟動子是具有方向性的,目的基因只有正確插入啟動子和終止子之間才能正確表達(dá)。在表達(dá)載體中綠色熒光蛋白基因作為 標(biāo)記基因標(biāo)記基因,要使其成功表達(dá),圖b中還缺啟動子,請判斷即將插入的啟動子方向 向左向左(填“向左”或“向右”)。
(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增γ基因上游不同DNA片段的原理是 DNA雙鏈復(fù)制DNA雙鏈復(fù)制,為使PCR反應(yīng)體系中的模板解鏈為單鏈,需要滿足的條件是 加熱至90-95℃加熱至90-95℃。
(3)將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體指導(dǎo)綠色熒光蛋白基因表達(dá),需要在引物末端添加限制酶識別序列。據(jù)圖可知,在R末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶應(yīng)為 EcoRIEcoRI,在F1~F7末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是 SalISalI。
(4)從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個過程中,除限制酶外,還必須用到的工具酶有DNA連接酶和 耐高溫的DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶。
(5)將構(gòu)建的載體導(dǎo)入除去BCL11A基因的受體細(xì)胞,成功轉(zhuǎn)化后,含F(xiàn)1~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的載體表達(dá)熒光蛋白,受體細(xì)胞有熒光,含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光。含F(xiàn)7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光的原因是 F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá)F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá)。
(6)向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素,含F(xiàn)1~F4與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞不再有熒光,而含F(xiàn)5~F6與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞仍有熒光。若γ基因上游調(diào)控序列上與引物序列所對應(yīng)的位置不含有BCL11A蛋白的結(jié)合位點(diǎn)序列,據(jù)此結(jié)果可推測,BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于 引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上。
【答案】RNA聚合酶;標(biāo)記基因;向左;DNA雙鏈復(fù)制;加熱至90-95℃;EcoRI;SalI;耐高溫的DNA聚合酶;F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物不含完整的啟動子,熒光蛋白基因不表達(dá);引物F4與F5在調(diào)控序列上所對應(yīng)序列之間的區(qū)段上
【解答】
【點(diǎn)評】
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